Odczynniki

Odczynniki, pwr biotechnologia(I stopień), VI semestr, Inżynieria genetyczna - laboratorium, Notatki

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->ODCZYNNIKITutaj wpisujmy odczynniki stosowane na zajęciach...pytania o nie lubią się pojawiać na kole. Proszę ozachowanie formy wpisywania tak jak jest poniżej.ITE-bufordo przechowywania DNA (Tris-zapewnia odpowiednie pH, EDTA- chelatuje jony Mg2+niezbędne do działania np DNaz; EDTA odmiareczkowuje również ewentualne “zabrudzenia” jonamiMg2+, np. z rąk) [uwaga: wraz ze wzrostem temperatury buforu Tris, jego pH spada i na odwrót]BSA-białkoinertne-nie wpływa na układ, powoduje, że DNA nie osadza się na ściankach eppendorfki,zwiększa stabilność endonukleaz restrykcyjnych, wiąże zanieczyszczenia obecne w preparatach DNATrixton X-100-delikatnydetergent, stabilizuje, poprawia rozpuszczalność białka6xSB(6x bufor do nanoszenia próbek na żel agarozowy)- 100mM EDTA, fikol (“obciążacz”), błękitbromofenolowy (barwnik umożliwiający śledzenie przebiegu elektroforezy), ksylenocyjanolII Odczynniki do Gel-Out:Roztwór R7S-roztwórdo rozpuszczania agarozy, ma wysokie stężenie soli chaotropowej, powodujeona, że DNA wiąże się z kolumną (powinowactwo DNA do złoża krzemionkowego w obecności solichaotropowych). Zwiększa siłę jonową. Współdziała z izpropanolem(odwadnia DNA)Izopropanol-odwadnianieDNA, zmniejszanie rozpuszczalności, wytrącanie DNARoztwór A1-bufordo płukania, płucząc nim DNA nie odrywa się od kolumny (zawiera jakiś ‘tajemniczy’związek organiczny, który trzyma DNA), wypłukuje całą zawartość soliTE- likwiduje oddziaływania hydrofobowe - wypłukanie DNA z kolumny i przechowywanieTBE-Tris/ boran / EDTA, roztwór buforowy zawierający mieszaninę Trisu, kwasu borowego i EDTATris-HCl- utrzymuje DNA w formie zdeprotonowanej i rozpuszczalnej w wodzieIIIRoztwór G-IVPożywka płynna LB- bogata pożywka do mikrobiologicznej hodowlii bakterii (ekstrat drożdzowy -witaminy i mikroelemetny; hydrolizad kazeinowy - białko; NaCl - odpowiednia osmotyczośc środowiska,jony Na+ niezbędne do transportu blonowego)Podłoże LB-agar z tetracykliną- podłoże stałe, do selekcji na podstawie odporności (ekstratdrożdzowy -jw, hydrolizat kazeinowy - jw, NaCl- jw, agar - czynnik żelujący, tetracyklina - antybiotyk,czynnik selekcjonujący). Pożywka nie jest buforowana i pH się będzie zmieniało podczas wzostu bakteriii wydzielania przez nie do środowiska produktów przemiany materii, stąd przy składzie jest dopisek 1NNaOHRoztwór A- 100mM MgCl2(jony Mg2+ niezbędne do działania, np. DNaz), sterylny, schłodzony na lodzieRoztwór B- 100mM CaCl2 (jony Ca2+, jony dwuwartosciowe, niezbedne do działania), sterylny,schładzon y na lodzieRoztwór C- 100mM CaCl2 (jony Ca2+, jw), 20% glicerol(wyższa gęstośc próbki), sterylny, schładzonyna llodzieVVIBufor 2xSB -Tris-HCl (zapewnia odpowiednie pH), 4% SDS(czynnik redukujący), 10% B-merkaptoetanol ( czynnik denaturujący, np. np. drugorzędową strukturę białek, wiązania S-S, dodajesię go na świeżo! - ponieważ jest termodynamicznie niestabilny!), 20% glicerol, 0,005% błękitbromofenolowyBUFOR DO ELEKTROFOREZY BIAŁKOWEJIPTG -induktorZnCl2 -mam napisane, że dzięki temu białka nie będą sfałdowane(?) Ja mam z kolei, ze jony cynkukonieczne sa do wytworzenia palca cynkowego, ktory znajduje sie w DBD; tak, chodzi o palce cynkowe,czyli Zn2+ umożliwia prawidłowe fałdowanie się białkaBUFORYENZYMY RESTRYKCYJNEPRZECHOWYWANIE:-20 C-Tris-HCl (pH 7 w 25C)-KCl - zwiększa siłę jonową buforu-DTT-stabilizacja ER jak i zanieczyszczeń-EDTA- chelatuje jony dwuwartościowe-BSA - zapobiega “przyklejaniu się” białek do ścianek eppendorfki-glicerol-zapobiega zamarzaniu przy przechowywaniuW REAKCJI:więkoszość 37 C 1h, zależy jak zaprojektujemy i jaki enzym-Tris-HCl (pH 7 w 37C)-MgCl2 - Mg2+ jako kofaktor dla ER-BSAFOSFATAZAPRZECHOWYWANIE:-20 C-HEPES-NaOH (pH 7,4) HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid)-MgCl2-ZnCl2-Triton-X-glicerolW REAKCJI:10 min. 37 C-Tris-HCl (pH 8 w 37)-MgCl2-KCl-Triton-X-BSAPOLIMERAZA:PRZECHOWYWANIE:-Tris-HCl(pH 8.0)-DTT-EDTA-KCl-Nonidet P40-is a nonionic, non-denaturing detergent-Tween 20-50% glicerolBUFOR Z KCl:-Tris-HCl (pH 8.8 w 25 C)-KCl-0.8% Nonidet P40BUFOR Z (NH4)2SO4:-Tris-HCl (pH 8.8 w 25C)-(NH4)2SO4-0.1 % Tween 20AKTYWNOŚĆ POLIMERAZY:-Tris-HCl (pH 8.8 w 25C)-MgCl2-2-merkaptoetanol-NaCl-BSA- aktywowane DNA ze śledziony łososia wg. FermentasLIGAZAREAKCJA-Tris-HCl (pH 7,8 w 25 C)-MgCl2-ATP-ditiotreitol [ Pobierz całość w formacie PDF ]

zanotowane.pl

doc.pisz.pl

pdf.pisz.pl

happyhour.opx.pl