Odzyskiwanie fragmentów DNA z ...

Odzyskiwanie fragmentów DNA z żeli elektroforetycznych, st. Biotechnologia podręczniki, Materiały - ...

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
ćwiczenie 5
ODZYSKIWANIE FRAGMENTÓW DNA Z ŻELI ELEKTROFORETYCZNYCH
W pracach genetyki molekularnej często zachodzi konieczność odzyskania z żelu elektroforetycznego określonych frakcji
DNA lub RNA. Czynność ta, zwana elucją, wykorzystywana jest między innymi w następujących pracach:
1.
DNA uzyskany w wyniku klonowania zazwyczaj poddawany jest subklonowaniu, tzn. insert lub jego fragment zostaje
przeniesiony z jednego wektora do innego. Przeniesienie insertu do nowego wektora jest konieczne, gdyż wektory stosowane do
klonowania DNA nie dają takich możliwości badawczych, jakie można uzyskać z wykorzystaniem innych wektorów, np.
wektorów ekspresyjnych lub wektorów do transformacji organizmów eukariotycznych.
2.
Subklonowanie konieczne jest również wówczas, gdy w wyniku klonowania uzyskano duży fragment DNA, np. klon
genomowy obejmujący kilka genów, a celem pracy jest sklonowanie pojedynczego genu lub jego fragmentu.
3.
Elucja z żelu elektroforetycznego wykonywana jest również wtedy, gdy sklonowany fragment DNA, chcemy oddzielić od
wektora a aby poddać go reakcji znakowania, np. radioaktywnym izotopem. W niektórych przypadkach DNA po znakowaniu,
ponownie poddawany jest elektroforezie, tym razem w celu oddzielenia wyznakowanej cząsteczki od radioaktywnych
nukleotydów, które nie zostały do niej wbudowane.
Fragmenty DNA mogą być izolowane zarówno z żeli agarozowych jak i poliakryloamidowych. Do elucji DNA z żeli
agarozowych mogą być wykorzystywane agarozy o normalnej temperaturze topnienia lub agarozy niskotopliwe. Agarozy
niskotopliwe, dzięki wstawieniu grup hydroksyetylowych w łańcuchu polisacharydowym agarozy, polimeryzują w temp. ok. +29
o
C i
depolimeryzują w temp. +65
o
C, czyli poniżej temperatury topnienia DNA. Dzięki temu wycięty fragment agarozy, zawierający daną
frakcję DNA, można stopić termicznie, a następnie oddzielić od niego DNA, np. na drodze ekstrakcji fenolowej. W celu oddzielenia
DNA od roztopionej agarozy można również stosować zamrażanie w –80
o
C. Po rozmrożeniu preparatu, wytrącona agaroza zostaje
odwirowana do osadu a uwolniony DNA pozostaje w supernatancie. Niektóre typy agaroz niskotopliwych, o wysokiej czystości,
umożliwiają przeprowadzanie reakcji enzymatycznej bezpośrednio w roztopionym żelu. Wadą żeli wykonanych z niskotopliwej
agarozy jest ich niższa rozdzielczość w porównaniu do rozdziałów elektroforetycznych przeprowadzonych w normalnych agarozach.
Używane do elucji agarozy o normalnej temperaturze topnienia nie mogą zostać stopione termicznie gdyż temperatura, którą
należałoby zastosować, czyli ponad +60
o
C, spowodowałaby denaturację DNA. Dlatego do stopienia wyciętego fragmentu agarozy
wykorzystuje się niektóre związki chemiczne, np. NaJ. Po chemicznym rozpuszczeniu agarozy, do odzyskania DNA z roztworu
często wykorzystuje się zdolność mikrokuleczek krzemowych do adsorpcji kwasów nukleinowych na swojej powierzchni. Kuleczki
z przyłączonym DNA tworzą zawiesinę, którą może łatwo oddzielić od roztworu na drodze wirowania. Dodanie do uzyskanego
osadu wody lub buforu TE powoduje oddysocjowanie DNA z kuleczek. Metoda ta, ze względu na krótki czas trwania i wysoką
wydajność jest obecnie bardzo często wykorzystywana.
Elucja wykonana przy zastosowaniu
DEAE-celulozy
(
d
i
e
tylo
a
mino
e
tyl) nie
wymaga topienia agarozy. Przeniesienie DNA na DEAE celulozę odbywa się w trakcie
rozdziału elektroforetycznego, podczas którego fragment bibułki DEAE celulozy należy
umieścić w żelu na drodze migracji DNA. W metodzie tej wykorzystuje się właściwości
jonowymienne DEAE celulozy. W warunkach elektroforetycznych, czyli przy
stosunkowo niskim stężeniu soli i neutralnym pH, grupy funkcyjne DEAE-celulozy,
obdarzone ładunkiem dodatnim (+), wiążą cząsteczki DNA. Przeniesienie DEAE
celulozy do buforu o wysokim st. soli, np. NaCl, powoduje elucję DNA do roztworu.
DNA można również eluować z agarozy stosując wirowanie w probówce z filtrem. Wycięty fragment agarozy po nałożeniu na
filtr i odwirowaniu uwolni DNA, który wraz z buforem obecnym w żelu przedostanie się do probówki pod filtrem.
W przypadku elucji dużych fragmentów DNA, tzn. powyżej 5 tpz, gdy inne metody okazują się mało wydajne, zaleca się
stosowanie elektroelucji w woreczkach dializacyjnych. W metodzie tej wycięty fragment żelu z frakcją DNA przenosi się do
woreczka dializacyjnego a następnie całość umieszcza się w aparacie elektroforetycznym. Pod wpływem pola elektrycznego, DNA
migruje z żelu i zatrzymuje się przy wewnętrznych ściankach woreczka. Po usunięciu agarozy, DNA łatwo może zostać wypłukany z
woreczka do nowej probówki.
Oprócz przedstawionych technik spotkać można wiele innych sposobów odzyskiwania DNA z żeli agarozowych.
DNA z żeli
poliakryloamidowych
często eluowany jest po reakcji znakowania. W tym przypadku, przed przystąpieniem do
elucji należy zidentyfikować pozycję DNA z wykorzystaniem autoradiografii. Następnie fragment żelu z DNA lub RNA zostaje
wycięty, zmacerowany i zawieszony w buforze elucyjnym (1 mM EDTA, pH 8,0; 0,5 M octan amonu; 10mM octan magnezu; 0,1%
SDS). Całość poddawana jest następnie kilkunastogodzinnej inkubacji, podczas której kwasy nukleinowe dyfundują z
rozdrobnionego żelu do buforu. Po zakończeniu inkubacji zawiesinę żelu należy odwirować od buforu zawierającego uwolniony
DNA. Na zakończenie, DNA z roztworu należy wytrącić etanolem.
Sprzęt i odczynniki
–
agaroza niskotopliwa
–
trawiony DNA
–
aparaty elektroforetyczne
–
obciążacz LB
–
skalpel pęseta
–
chloroform
–
bufor TE 10/1
–
octan amonu 10M
–
etanol 96%
–
etanol 75%
–
DEAE celuloza (Schleicher & Schuell
NA-45
®
)
–
buf. NTE "low"
–
buf. NTE "high"
–
fenol
Postępowanie
I. Odzyskiwanie DNA z agarozy z wykorzystaniem ekstrakcji fenolowej
1.
Przygotować 1% żel z agarozy niskotopliwej,
zawierający bromek etydyny o stęż. 2,5 μg/ml.
2.
Do kieszonek nałożyć preparat DNA połączony z
barwnikiem elektroforetycznym.
3.
Aby uniknąć wzrostu temperatury, prowadzącej do
depolimeryzacji żelu, elektroforezę prowadzić przy
niskim napięciu prądu (<100V).
4.
W świetle UV wyciąć fragment żelu zawierający
prążek DNA i przenieść go do probówki eppendorfa.
Należy skrócić do minimum czas ekspozycji DNA w
świetle UV oraz odciąć większość agarozy, która nie
zawiera DNA.
5.
Stopić wycięty fragment żelu w temp. +65
o
C.
6.
Do rozpuszczonej agarozy dodać 4 objętości buforu TE
i wymieszać. Jeżeli w próbie widoczne są fragmenty
nierozpuszczonego żelu, kontynuować topnienie.
7.
Po rozpuszczeniu agarozy preparat ekstrahować 1 objętością
fenolu, przez ok. 2 min., a następnie próbę zwirować w
mikrowirówce przez 5 min.
8.
Fazę wodną, zawierającą DNA, przenieść do nowej
probówki eppendorfa uważając, aby nie pobrać interfazy
występującej pomiędzy fazą wodną i fenolową, gdyż
zawiera ona agarozę.
9.
Fazę wodną ekstrahować 1 objętością mieszaniny
chloroform: alkohol izoamylowy (24:1) przez 2 min. i
wirować w mikrowirówce przez 5 min.
10.
Z zebranej fazy wodnej wytrącić DNA dodając 0,2 objętości
10 M octanu amonu i 2,5 objętości schłodzonego, 95%
etanolu. Próbę trzymać 10 min w -20
o
C.
11.
Po odwirowaniu i wysuszeniu DNA, sprawdzić
elektroforetycznie ilość i jakość uzyskanego preparatu.
II. Odzyskiwanie DNA z agarozy z wykorzystaniem zamrażania.
1.
Przygotować 1% żel z niskotopliwej agarozy
zawierający bromek etydyny o stęż. 2,5 μg/ml.
2.
Do kieszonek nałożyć preparat DNA połączony z
barwnikiem elektroforetycznym.
3.
Aby uniknąć wzrostu temperatury, prowadzącej do
depolimeryzacji żelu, elektroforezę prowadzić przy
niskim napięciu prądu (<100V).
4.
W świetle UV wyciąć fragment żelu zawierający prążek
DNA i przenieść go do probówki Eppendorfa. Należy
skrócić do minimum czas ekspozycji DNA w świetle UV
oraz odciąć większość agarozy, która nie zawiera DNA.
5.
Fragment żelu zawierający DNA stopić w temp. +65
o
C.
6.
Do rozpuszczonej agarozy dodać 4 objętości buforu TE i
wymieszać całość. Jeżeli w próbie widoczne są
fragmenty nierozpuszczonego żelu, kontynuować
topnienie.
7.
Po stopieniu agarozy próbę zamrozić w -80
o
C.
8.
Po rozmrożeniu preparat wirować przez 5 min. przy 12
tyś. RPM.
9.
Ostrożnie oddzielić supernatant, zawierający DNA, od
osadu zawierającego agarozę.
10.
DNA z supernatantu wytrącić dodając 0,2 objętości 10M
octanu amonu i 2,5 objętości schłodzonego, 95% etanolu.
Próbę inkubować przez 10 min w temp. -20
o
C.
11.
Po odwirowaniu i wysuszeniu DNA, sprawdzić
elekoforetycznie ilość i jakość uzyskanego preparatu.
III. Odzyskiwanie DNA z wykorzystaniem DEAE-celulozy.
Bufor NTE "low"
Bufor NTE "high”
Przygotowanie DEAE celulozy do pracy
150 mM NaCl
1,0 M NaCl
Przycięte skrawki DEAE-celulozy płukać w następujących warunkach:
1.
5 min w 10mM EDTA
2.
5 min w 0,5N M NaOH
3.
6 razy w sterylnej wodzie
4.
bibułki przechowywać w wodzie w +4
o
C.
0,1 mM EDTA
0,1 mM EDTA
20 mM Tris-HCl pH 8,0 20 mM Tris-HCl pH 8,0
1.
Przygotować 1% żel agarozowy zawierający bromek
etydyny o stęż. 2,5 μg/ml.
2.
Na żel nałożyć DNA plazmidowy, po reakcji
restrykcyjnej.
3.
Prowadzić elektroforezę.
4.
Wykonać skalpelem nacięcie tuż pod prążkiem DNA
przeznaczonym do elucji.
5.
W uzyskanej szczelinie umieścić odpowiednio
przycięty fragment bibułki DEAE-celulozy.
6.
Żel ponownie umieścić w aparacie
elektroforetycznym i kontynuować rozdział do czasu,
aż prążek zostanie całkowicie zaadsorbowany przez
bibułkę (ok. 5-10 min).
7.
Bibułki wyjąć z żelu i sprawdzić w świetle UV czy
cały DNA został na nie przeniesiony.
8.
Bibułkę pociąć sterylnymi nożyczkami, umieścić w
probówce eppendorfa i zalać 500 μl medium NTE
"low", po czym wytrząsać ok. 30 sek. w celu usunięcia
resztek agarozy.
9.
Po usunięciu buf. „low” zalać bibułkę 100 μl buforu
NTE "high". Próbę inkubować przez 15 min. w temp.
+65
o
C. W roztworze o wysokiej sile jonowej następuje
uwolnienie DNA z DEAE celulozy.
10.
Roztwór znad bibułki przenieść do nowej probówki
eppendorfa i wytrącić DNA 2,5 objętościami
schłodzonego, 98% etanolu. Próbę trzymać 10 min w
temp. -20
o
C.
11.
Po odwirowaniu i wysuszeniu DNA, sprawdzić
elekoforetycznie ilość i jakość uzyskanego preparatu.
[ Pobierz całość w formacie PDF ]

zanotowane.pl

doc.pisz.pl

pdf.pisz.pl

happyhour.opx.pl